CORPÚSCULOS DE NEGRI

INVESTIGACIÓN DE CORPÚSCULOS DE NEGRI

INTRODUCCIÓN

            En el diagnóstico de laboratorio de la rabia las técnicas empleadas deben ofrecer condiciones óptimas de precisión, rápidez y economía, ya que es una enfermedad zoonótica la cual produce terrible sufrimiento a las víctimas de la infección y que además luego de la presentación de los síntomas la enfermedad resulta invariablemente fatal.

            Cumplen con éstos requisitos las siguientes técnicas:

·         Investigación microscópica de corpúsculos de Negri, que consiste en realizar Tinción de Seller a improntas de tejido encefálico sospechoso.

·         Prueba Biológica: que consiste en realizar inoculación intracerebral a ratones de 3 días de edad de una suspensión de 10-20% de material encefálico sospechoso.

·         Prueba de anticuerpos fluorescentes.

OBJETIVOS

1.    Reconocer la importancia de la tinción de Seller para el diagnóstico de la rabia.

2.    Conocer cómo se lleva a cabo la técnica

3.    Observar placas positivas a la tinción de Seller.

4.    Demostrar la importancia del cumplimiento de las normas de Bioseguridad durante el desarrollo de técnicas de diagnóstico que implican alto riesgo.

PROCEDIMIENTO

Preparación de las soluciones madres y el tinte:

a.    Solución A: a un litro de metanol absoluto añada 10 gr de azul de metileno, guarde en envase de vidrio ámbar.

b.    Solución B: a 500ml de metanol absoluto añada 5gr de fuchsina básica, deposite en envase de vidrio ámbar.

c.    La solución del tenido se prepara 2 partes de solución A más una parte de la Solución B. Se debe homogenizar amabas soluciones más no filtrarlas. Se recomienda esperar hasta 24 horas antes de su utilización.

Preparación de las Improntas:

a.    Muestras de hipocampus, corteza y cerebelo se seccionan con un bisturí.

b.    Se colocan sobre depresores cuidando de que la superficie recién cortada quede arriba.

c.    Utilizando portaobjetos completamente limpios se tocan las superficies seccionadas del tejido haciendo una ligera presión. Esto provocará que quede adherida a la superficie del portaobjetos una capa sumamente delgada de tejido de la muestra.

d.    Pueden hacerse de tres a cuatro improntas por placa.

e.    Aún húmeda la placa se cubre con el tinte.

f.     Se espera unos segundos y se enjuaga con agua común.

g.    Luego del enjuague se dejan secar.

h.    De gran importancia es el conocimiento de algunas modificaciones de ésta tinción, la más ampliamente utilizada es la tinción modificada de Lentz.

i.      El examen de las placas se realiza primero bajo objetivos de bajo poder, luego de localizadas las áreas que contienen numerosas neuronas se selecciona el objetivo de inmersión.

j.      Los corpúsculos de Negri se observan como inclusiones citoplasmáticas generalmente redondas cuyo tamaño oscila entre 0.24 y 0.27 µm de diámetro y color magenta, mientras el resto de la neurona se observará de color azul.

CONESTE LAS SIGUIENTES PREGUNTAS

1.    En que consiste la tinción modificada de Lentz.

2.    ¿Se consideran los corpúsculos de Negri patognomónicos de la enfermedad de la rabia?

3.    Mencione algunas enfermedades que podrían producir otras inclusiones citoplasmáticas acidófilas.

4.    Realice dibujos de sus observaciones.

MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Y XENODIAGNÓSTICO

SISTEMAS BIOLÓGICOS I

MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Y XENODIAGNÓSTICO

INTRODUCCIÓN

            Los animales de experimentación poseen gran importancia para la constante expansión de los conocimientos en las ciencias médicas. Actualmente en todos los campos de la ciencia los animales cumplen su papel tanto a través de la investigación, como para la realización de diversas pruebas de gran utilidad.

            Por ésta y muchas otras razones los animales deben ser empleados siempre dentro de un marco estricto de principios éticos. Éste tema ha recibido mucha atención y actualmente existen programas que estimulan el desarrollo de sistemas in-vitro que sustituyan el uso de animales, sin embargo hay circunstancias en que se hace inevitable su utilización. Cuando es así, las normas éticas obligan al investigador  a causar el menor sufrimiento posible a los animales en experimentación. Tales normas han sido de gran aceptación a nivel de la comunidad científica internacional a tal punto que su aplicación en proyectos de investigación se considera como requisito indispensable para su publicación por las revistas científicas.

            En el área de la microbiología la utilización de los animales es bastante amplia el ejemplo más representativo lo constituye el xenodiagnóstico, que consiste en reproducir la enfermedad en un animal de laboratorio para observar sus manifestaciones clínicas y lesiones anatomopatológicas tanto macro como microscópicamente de los diferentes sistemas. Igualmente se consideran estos sistemas biológicos de gran utilidad para el mantenimiento y recuperación de cepas  de microorganismos, para la obtención de componentes plasmáticos en inmunología tales como anticuerpos, complementos, etc.

OBJETIVOS

1.    Conocer la importancia que tienen los animales de laboratorio en la microbiología

2.    Describir diferentes métodos y técnicas de sujeción para diferentes especies animales.

3.    Practicar los métodos más comunes de inoculación en animales de laboratorio.

MATERIALES

1.    Ratones de laboratorio

2.    Cámaras para mantenimiento de estas especies.

3.    Alimento suficiente para cuatro semanas.

4.    Guantes

5.    Jeringuillas

6.    Agujas calibre 25 a 26

7.    Alcohol yodado

8.    Algodón

PROCEDIMIENTO

1.    Con los dedos pulgar e índice de la mano menos hábil sostener el ratón en la zona de la nuca y el dorso cuidadosamente de forma que la piel quede ligeramente tensada, impidiendo que gire su cabeza.

2.    Vía intraperitoneal

Para la inoculación intraperitoneal se recomienda trabajar con animales en ayuno desde la noche anterior para reducir la posibilidad de una punción visceral.

a.    Colocar el ratón con el abdomen hacia arriba y ligeramente inclinado hacia un costado, para desplaza las vísceras.

b.    Realizar la asepsia

c.    Realizar la punción en el lado contrario

d.    Introduciendo la aguja con un ángulo de 45°

e.    Se pueden inocular volúmenes hasta de 2ml.

3.    Vía intramuscular

a.    Con la ayuda de otro manipulador se extiende sus extremidad posterior

b.    Se realiza la asepsia del área

c.    Se realiza la inoculación en la zona del tercio posterior del muslo

d.    Los volúmenes de inoculación admisibles están entre 0.05 a 0.2ml

4.    Vía intravenosa, se prefieren ratones adultos que hayan alcanzado los 20gr de peso

a.    Es imprescindible utilizar un dispositivo de sujeción en forma de tubo donde el animal quedará completamente inmovilizado.

b.    Se utilizan las venas causales las cuales deben dilatarse previamente introduciendo la extremidad caudal en agua a temperatura entre 50 y 55°C durante un minuto antes de la inoculación.

c.    Introducir la aguja, con el bisel hacia arriba, de forma casi paralela a la arteria.

d.    El embolo no debe ofrecer resistencia para la inoculación, lo contrario indicará que la punción no se ha realizado adecuadamente.

e.    Debe depositarse lentamente el volumen del inóculo.

f.     Se recomienda utilizar volúmenes entre 0.1 a 0.3ml.

5.    Vía Intradérmica

a.    Se realiza en la piel del abdomen, por lo que puede ser necesario rasurar previamente.

b.    Introducir la aguja, con el bisel hacia arriba, de forma casi paralela a la piel, la cual debe tensarse previamente para evitar la formación de arrugas

c.    El volumen máximo para esta especie animal es de 0.05ml

d.    Para evitar pérdida del volumen inoculado se recomienda aguja calibre 27 o menor.

6.    Vía subcutánea

a.    Se realiza levantando la piel e introduciendo la aguja en el espacio entre piel y tegumentos.

b.    Puede realizarse en el área del dorso, cuello, o entre los orejas.

c.    Admite volúmenes mayores.

NOTA: EL PROFESOR REALIZARÁ DEMOSTRACIONES PREVIAS DE TODAS LAS TÉCNICAS.

CONTESTE LAS SIGUIENTES PREGUNTAS

1.    Mencione algunas enfermedades que se diagnostican a través del xenodiagnóstico en nuestro país.

2.    Diga que organizaciones u organismos internacionales regulan la utilización de animales de laboratorio.

3.    Como futuro médico veterinario que papel considera que debe cumplir como profesional en ésta área. Explique

4.    Haga un diagrama donde refleje vías de inoculación de elección, volúmenes de inoculación, calibres de agujas, en las diferentes especies animales.

LISIS DE BACTERIAL POR BACTERIÓFAGOS

OBJETIVO

Determinar la concentración de los bacteriófagos por suspensión dentro de los medios de plaquetas modificadas.

INTRODUCCIÓN

Los agentes virales que atacan a las bacterias, normalmente son llamados bacteriófagos (fagos). Son considerados una representación general natural de los virus. Así son usados como modelos para entender la replicación viral en las células hospederas-virus y su interacción. Ellos tienen una acción muy específica, los bacteriófagos pueden actuar en un medio de bacterias, dentro de una especie y de no atacar a otras en otros medios. La virulencia de los bacteriófagos lisan la célula bacteriana, esto demuestra que en los medios de cultivo, por medio de cultivos limpios o medios de agar o en zonas limpias de plaquetas. Así los virus pueden ser usados en estudios epidemiológicos para identificar medios específicos de bacterias.

Hay otros fagos que llevan a cabo ese círculo lítico dentro de la célula, más bien un ciclo lisogénico dentro de la célula hospedera, el ácido nucleico de los fagos está incorporado dentro de la célula hospedera o dentro del cromosoma, ahora lo llamaremos FAGOCITOSIS. Con esto la bacteria genera ocurrencia lítica o no ocurre lisis en ese momento, así la temperatura de los fagos es muy importante porque esto viene a ser responsable de la producción de difteria tóxica, toxina botulínica y otras toxinas en la célula hospedera, asi los fagos tienen una implicación en el desarrollo de antibióticos y su resistencia a las bacterias. El segundo estilo de vida de los bacteriófagos está descrita en la Figura 43.1

La bacteria hospedera más común usado para trabajar con bacteriófagos es la Escherichia coli  y se estudia un grupo de fagos alrededor de lo que se llama las series T, numerados de 1 hasta 7,  esto ataca a medio no móviles de E.coli. Son designados de T1, T2, T3…T7 (T por tipo).

Los fagos T tienen una forma como de espermatozoide, con una cabeza polihídrica (más o menos de 50µm de diámetro), y una cola estrecha. Su cabeza es una línea sencilla de moléculas de ácidos nucleicos alrededor de una estrecha capa de más o menos 50µm de largo, y considerado una doble hélice de cadena ADN. El DNA está estrechamente condensado en la cabeza del fago está literalmente emergido en unos tubos de proteínas y cerrado  con un cierre contráctil. Un tipo de bacteriófagos se pueden observar en la figura 43.2.

Un círculo lítico se puede describir en la Figura 43.1, el fago se adhiere a la pared celular de la bacteria con un receptor viral.

La capa proteica del fago permanece fuera de la célula, sigue un re-direccionamiento a la célula hospedera gracias al material del fago en lugar de materia celular. Los nuevos fagos se replican dentro de la bacteria, rompen la salud, salen las nuevas partículas del fago.

El nuevo virón reinyecta y subsecuentemente rompe o lisa más celular. Esta continúa siendo el ciclo de lisis reinfectantando o introduciendo visibles plaquetas en las células.

Partes de Un bacterófago

REFERENCIAS

·         MICROBIOLOGY, Chap.15. “Viruses: Morphology, Clasification, Replication”

·         MICROBIOLOGY, Chap.16, “Viruses: Cultivation Methods, Pathogenicity”.

MATERIALES

·        2 platos Petri con agar tripticasa y soya

·        10 tubos con 9ml cada uno de caldo tripticasa

·        9 pipetas esteriles de 1ml (con algodón en la boquilla)

·        muestra del bacteriófago de escherichia coli ajustado para tener un título de aproximadamente 10⁵  unidades formadoras de placa (cfu) / ml

·        trypticase - cultivo en caldo de 6 a 12 horas cepa sensible a bacteriófagos de E. coli.

PROCEDIMIENTO

Acomode 10 tubos de caldo de tripticasa por hilera en un tubo de ensayo, etiquételos del 1 al 10.

1.. Usando una precaución aséptica, transfiera 1 ml de la muestra del fago al tubo. Deseche el pippete, con una pipeta nueva mezcle las páginas y el caldo, extrayendo aproximadamente 0.5 ml de la mintura.

2. coloque una gota de E.coli en cada una de las dos placas de agar con tripticasa que se proporcionan. 

3.. invierta las placas, dibuje cinco líneas en la parte inferior de cada una, y marque las líneas numéricamente como se siembran debajo

4. Ahora retire un bucle de material del tubo I y raya esto en la superficie de la placa de agar que sigue

5. agregue 1 gota del cultivo de caldo Escheria coli a cada uno de los 10 tubos preparados para 2 tubos preparados con este procedimiento. Incubar a 35°C.

DILUCIONES SERIADAS SEROLÓGICAS

DILUCIONES SERIADAS SEROLÓGICAS

INTRODUCCIÓN

Una dilución en serie es la reducción progresiva, paso a paso, de la concentración de una sustancia en disolución. Por lo general, el factor de dilución en cada paso es constante, lo que da como resultado una progresión geométrica de la concentración, en forma logarítmica. Las diluciones en serie se utilizan para crear disoluciones muy diluidas con precisión, así como disoluciones para experimentos en los que se pretenda estudiar curvas de concentración con una escala logarítmica. Las diluciones en serie son ampliamente utilizadas en las ciencias experimentales, incluyendo bioquímica, química, farmacología, microbiología y física, así como en la homeopatía.

El factor de dilución es el número total de volúmenes al que se lleva un volumen dado de muestra original, o parte alícuota. En otros términos, el factor de dilución también corresponde a la división de la concentración de la muestra original sobre la concentración de la muestra diluida.

En biología y medicina, además de los usos más convencionales, descritos anteriormente, la dilución en serie también se puede utilizar para reducir la concentración de microorganismos o células de una muestra. Como, por ejemplo, el número de colonias de bacterias que crecen en una placa de Petri en un momento dado depende de la concentración, y dado que muchas otras técnicas de diagnóstico implican contar físicamente el número de microorganismos o células en ciertas áreas impresas dentro de una rejilla (comparando las concentraciones de dos tipos de células o microorganismos en la muestra) o en cavidades de un volumen determinado (para concentraciones absolutas), la dilución puede ser útil para obtener resultados más manejables o para tener un número definido de colonias de cultivo en cada placa. La dilución en serie es también un método más barato y más sencillo para preparar los cultivos de una sola célula que el empleo de pinzas ópticas y micromanipuladores.

OBJETIVOS.

-Realizar diluciones seriadas de  muestras

MATERIAL.

Ø  Colorantes

Ø  Agua destilada.

Ø  Equipo de pepiteado.

Ø  Tubos de ensayo.

Ø  Puntas amarillas y Azules para micropipetas.

Ø  Micropipetas de 1000 y 200 ul.

Ø  3 Frascos de vidrio.

Ø  Matraz Erlenmeyer.

Ø  3 Vasos de precipitados de 100 ml

Reactivos:

-Cristal Violeta.

-Lugol.

-Safranina.

-azul de metileno

-verde malaquita

PROCEDIMIENTO

1.      En primer lugar usaremos  colorantes como analítos con capacidad cromógena para elaborar  baterías de diluciones.

2.      En primer lugar elaboraremos el banco de diluciones con un factor dilución 1/2. Luego utilizaremos diluciones de 1/5 y 1/10.

CONTESTE LAS SIGUIENTES PREGUNTAS

1.      ¿Qué es una solución?

2.      ¿Cuántas clases de concentraciones de Normalidad existen?,describa cada una de ellas

3.      ¿Qué significan: v/v, p/v, p/p y ppm?

4.      ¿Qué es una solución isotónica?

5.      ¿Qué es una solución osmolar?